单片段无缝克隆试剂盒
| 货号 | 次数 |
| NC01011 | 30次 |
| NC01012 | 60次 |
使用范围
适用于快速提取植物组织、细胞、真菌基因组 DNA。
试剂盒组成、储存、稳定性
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试剂名称 |
储存条件 |
30 次 （NC01011） |
60 次 （NC01012） |
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2 × OneStep Cloning Mix |
-20℃ |
50μL × 3 |
50μL × 6 |
-20℃保存， 避免反复冻融。
产品介绍
一步法无缝克隆试剂盒不依赖于 T4 连接酶，不受载体和目的片段的酶切位点限制，而直接 用重叠片段重组的方法，采用特殊的酶组合可以将任意方法线性化后的载体和与其两端具有 16- 25bp 重叠区域的 PCR 片段定向重组连接，可以 30 分钟内实现平末端 PCR 产物片段高效定向 无缝克隆至载体的任意位点。
产品特点
· 15 分钟可以将一个 50bp-15kb PCR 扩增片段（平端）克隆插入任意载体的任意位置。
· 不受载体和插入片段酶切位点的可用性和平端 / 粘性末端的限制，可以在任意位点进行克隆。 · 无缝克隆，插入点不会引入不需要的碱基序列。
· 不依赖于连接酶及磷酸酶，高效，准确，克隆阳性率可达 95% 以上。
线性化载体和插入 DNA 片段的制备
A：线性化载体的制备
酶切来源： 酶切所得线性载体，平末端或者粘端、单酶切或者双酶切均可，酶切后胶回收。
注：一步法无缝克隆反应体系内无双链 DNA 连接酶，不会发生载体自连反应。因此，即使 是以单酶切方式制备的线性化载体也无需进行末端脱磷酸处理。重组产物转化后出现的假阳性克 隆 ( 无插入片段 ) 是由酶切不完全未线性化环状载体转化而形成的。我们推荐酶切后胶回收可以 把这种未线性化载体比例降低到最低程度。
反向 PCR 来源： 建议使用高保真 DNA 聚合酶制备，如果扩增条带单一可以通过 PCR 产 物纯化获得载体，否则通过胶回收获得载体。
注：反向 PCR 的质粒模板也是非线性化载体，也可能导致假阳性克隆（无插入片段） ，因 此 PCR 来源线性载体（PCR 产物）纯化前用 Dpn I 内切酶消化质粒模板，可以降低背景，提高 阳性率。但是一般情况下，经过胶回收已经足以把这种未线性化载体比例降低到最低，因此反向 PCR 来源的线性化载体我们也推荐胶回收。
B：插入 DNA 片段的制备
一步法无缝克隆引物设计总的原则是：通过在引物 5’端引入线性化克隆载体末端同源序列， 使得插入片段扩增产物 5’和 3’最末端分别带有和线性化克隆载体两末端对应的完全一致的序 列 (16 bp ～ 20 bp)。
插入片段引物设计： 克隆引物包括插入片段特异性引物序列和重叠序列。
克隆正向引物 (5’-3’)：线性载体正向 16-25 nt 重叠区序列 (3’末端算起 )+ 插入片段正 向特异引物序列（18-25 nt）。
克隆反向引物 (5’-3’)：线性载体反向 16-25 nt 重叠区序列 (3’末端算起 )+ 插入片段反 向特异引物序列（18-25 nt）。
注意：重叠区的碱基数至少 16 bp，并且多段重叠区域之间的 Tm 值需保持一致且>60℃ (AT pair = 2℃ and GC pair = 4℃ )，否则可延长碱基数目直到符合要求。
线性化载体的两端因线性方式（如单酶切、双酶切、反向 PCR）不同，可以是以上三种末 端结构的两两任意组合，插入片段特异性引物设计的原则遵循一般引物设计的原则即可。
计算扩增引物退火温度时，只需计算基因特异性扩增序列的 Tm 值，载体末端同源序列不应 参与计算。
酶的选择： 建议使用高保真 DNA 聚合酶或者 PCR Mix。
反应条件： 一般按照具体使用的聚合酶说明书进行即可。
纯化插入片段
· 可选：如果片段来源于质粒模板，且该质粒与重组载体具有相同抗性，纯化前用 Dpn I 内 切酶消化质粒模板， 可降低背景，提高阳性率。
· 如果片段单一 ，则建议用 PCR 产物纯化片段。
· 如果有非特异扩增，则建议用胶回收试剂盒回收片段。
· 使用该方法克隆，用来线性化载体的酶切位点在拼接的时候会缺失，如果对酶切位点有严 格要求的，建议注意酶切位点的选择，必要时可在正反向克隆引物的重叠区序列和特异基因序列 之间增加缺失掉的碱基来恢复原有酶切位点（见后面举例说明）。
· 如果重组质粒用于蛋白表达，则在引物设计时注意读码框，蛋白表达及纯化所需序列（如 启动子，RBS 序列，起始密码子，终止密码子，蛋白标签等）不被破坏。
根据上述设计原则，从 3’端开始计算，往回算 16bp-25bp（本举例采用了 20 bp 末端重 叠相同序列） ，加到目的片段特异引物序列前面即可。确保重叠区域的 Tm 值保持一致且﹥60℃ (AT pair = 2℃ and GC pair = 4℃ )。
正向引物具体如下：5' — GAGCCTAGGTGAGTTGGCCGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN —3' 注意：以上引物设计完成克隆连接后，EcoR I 酶切位点将会消失（不保留酶切位点）。
如果需要保留 EcoR I 酶切位点，需要在载体末端 20 bp 重叠序列和目的片段特异引物序列 之间补齐缺失的 EcoR I 识别位点序列 aattc，完成克隆连接后， EcoR I 酶切位点依然存在（保 留酶切位点）。
具体如下：5' — GAGCCTAGGTGAGTTGGCCGaattc NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN —3'
根据上述设计原则，从 3’端开始计算，往回算 16bp-25bp（本举例采用了 20 bp 末端重 叠相同序列），加到目的片段特异引物序列前面即可。确保重叠区域的 Tm 值保持一致且﹥60℃ (AT pair = 2℃ and GC pair = 4℃ )。
反向引物具体如下： 5' — CTGCCATCGGATCGTTCGCANNNNNNNNNNNNNNNNNNNN —3' 注意：以上引物设计完成克隆连接后，Hind III 切位点将会消失（不保留酶切位点）。
如果需要保留 Hind III 酶切位点，需要在载体末端 20 bp 重叠序列和目的片段特异引物序列 之间补齐缺失的 Hind III 识别位点序列 agctt ，Hind III 酶切位点依然存在（保留酶切位点）。
具体如下： 5' — CTGCCATCGGATCGTTCGCAagctt NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN —3'
操作步骤
注意：2×OneStep Cloning Mix 含有连接增强剂 PEG 很粘稠， 从冰箱拿出来温度低时 更粘稠，可以放在手心化冻几分钟提高温度便可降低粘稠度（不影响质量） ，手指拨打离心管底 充分混匀或者涡旋震荡充分混匀。
按照下表建立反应体系（可使用 PCR 管在室温配制）
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2 × Cloning Master Mix |
5 μL |
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Linear Vector (10-80 ng) |
X μL* |
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Insert(s) |
Y μL* |
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dd H2O |
To 10 μL |
* 载体一般用 20-50 ng，插入片段与载体的摩尔比在 2:1-3:1 之间最佳；如果插入片段小 于 200bp，插入片段与载体的摩尔比用 5:1 。
轻轻吹打混匀，在 50℃反应 15 分钟（可在 PCR 仪器上进行） ，反应结束后，将 PCR 管 置冰上后直接转化或者保存于 -20℃。较短片段例如 100bp-1kb 只需要 15 分钟便能获得足够 转化子，较长片段的连接，可以延长反应时间到 60 分钟。
取 5 μL 反应产物按照感受态细胞说明书进行转化（如果转化子较少，可以将所有的产物转 化并将所有的转化液涂板）。
阳性克隆的鉴定
可根据具体情况，选择菌落 PCR 鉴定，提取质粒（货号 NP03013）进行限制性内切酶鉴 定或测序鉴定。
说明书：
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