多片段无缝克隆试剂盒

货号	次数
NC02010	20次

适用范围

适用于快速提取植物组织、细胞、真菌基因组 DNA。

试剂盒组成、储存、稳定性

试剂名称	20 次
2 × Cloning Master Mix	100 μL

-20℃保存，避免反复冻融。

产品介绍

本制品不依赖于 T4 连接酶，不受载体和目的片段的酶切位点限制，而直接用重叠片段重组的方法，采用特殊的酶组合可以将任意方法线性化后的载体和与其两端具有 15-25bp 重叠区域的 PCR 片段（平端）定向重组，可以快速实现 1-5 个片段的高效无缝克隆。

产品特点

·15 分钟可以将一个或者多个长、短 PCR 扩增片段（平端）插入载体。

·不受载体和插入片段酶切位点的可用性和载体平端 / 粘性末端的限制，可以在任意位点进行克隆。 ·无缝克隆，插入点不会引入不需要的碱基序列。

·高效、准确，阳性率＞ 95% 。

操作步骤

注意：2×OneStep Cloning Mix 含有连接增强剂 PEG 很粘稠，从冰箱拿出来温度低时更粘稠，可以放在手心化冻几分钟提高温度便可降低粘稠度（不影响质量），手指拨打离心管底充分混匀或者涡旋震荡充分混匀。

按照下表建立反应体系（可使用 PCR 管在室温配制）

2 × Cloning Master Mix	5 μL
Linear Vector (10-80 ng)	X μL*
Insert(s)	Y μL*
dd H2O	To 10 μL

* 载体一般用 20-50 ng，插入片段与载体的摩尔比在 2:1-3:1 之间最佳；如果插入片段小于 200bp，插入片段与载体的摩尔比用 5:1 多片段连接情况下，片段与片段之间摩尔比为 1:1 。

轻轻吹打混匀，在 50℃反应 15 分钟（可在 PCR 仪器上进行），反应结束后，将 PCR 管置冰上后直接转化或者保存于 -20℃。较短片段例如 100bp-1kb 只需要 15 分钟便能获得足够转化子，较长片段的连接，可以延长反应时间到 60 分钟。

取 5 μL 反应产物按照感受态细胞说明书进行转化（如果转化子较少，可以将所有的产物转化并将所有的转化液涂板）。

阳性克隆的鉴定

可根据具体情况，选择菌落 PCR 鉴定，提取质粒（货号 NP03013）进行限制性内切酶鉴定或测序鉴定。

计算扩增引物退火温度时，只需计算基因特异性扩增序列的 Tm 值，载体末端同源序列不应参与计算。

正向引物设计举例说明（EcoR I 酶切开）

根据上述设计原则，从 3’端开始计算，往回算 16bp-25bp（本举例采用了 20 bp 末端重叠相同序列），加到目的片段特异引物序列前面即可。确保重叠区域的 Tm 值保持一致且﹥60℃ (AT pair = 2℃ and GC pair = 4℃ )。

正向引物具体如下：5' — GAGCCTAGGTGAGTTGGCCGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN —3' 注意：以上引物设计完成克隆连接后，EcoR I 酶切位点将会消失（不保留酶切位点）。

如果需要保留 EcoR I 酶切位点，需要在载体末端 20 bp 重叠序列和目的片段特异引物序列之间补齐缺失的 EcoR I 识别位点序列 aattc，完成克隆连接后， EcoR I 酶切位点依然存在（保留酶切位点）。

具体如下：5' — GAGCCTAGGTGAGTTGGCCGaattc NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN —3'

反向引物设计举例说明（Hind III 酶切开）

如上图，载体由 Hind III 酶切开，形成 5’突出末端：

反向引物具体如下： 5' — CTGCCATCGGATCGTTCGCANNNNNNNNNNNNNNNNNNNN —3' 注意：以上引物设计完成克隆连接后，Hind III 切位点将会消失（不保留酶切位点）。

如果需要保留 Hind III 酶切位点，需要在载体末端 20 bp 重叠序列和目的片段特异引物序列之间补齐缺失的 Hind III 识别位点序列 agctt ，Hind III 酶切位点依然存在（保留酶切位点）。

具体如下： 5' — CTGCCATCGGATCGTTCGCAagctt NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN —3'

线性化载体和插入 DNA 片段的制备

A：线性化载体的制备

酶切来源：酶切所得线性载体，平末端或者粘端、单酶切或者双酶切均可，酶切后胶回收。

注：一步法无缝克隆反应体系内无双链 DNA 连接酶，不会发生载体自连反应。因此，即使是以单酶切方式制备的线性化载体也无需进行末端脱磷酸处理。重组产物转化后出现的假阳性克隆 ( 无插入片段 ) 是由酶切不完全未线性化环状载体转化而形成的。我们推荐酶切后胶回收可以把这种未线性化载体比例降低到最低程度。

反向 PCR 来源：建议使用高保真 DNA 聚合酶制备，如果扩增条带单一可以通过 PCR 产物纯化获得载体，否则通过胶回收获得载体。

注：反向 PCR 的质粒模板也是非线性化载体，也可能导致假阳性克隆（无插入片段），因此 PCR 来源线性载体（PCR 产物）纯化前用 Dpn I 内切酶消化质粒模板，可以降低背景，提高阳性率。但是一般情况下，经过胶回收已经足以把这种未线性化载体比例降低到最低，因此反向 PCR 来源的线性化载体我们也推荐胶回收。