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植物基因组DNA快速提取试剂盒

ꄲ后一个： Complex Plant RNA Kit 多糖多酚/复杂植物RNA快速提取试剂盒

货号	次数
NP05013	200次
NP05012	100次
NP05011	50次

适用范围

适用于快速提取植物组织、细胞、真菌基因组 DNA。

试剂盒组成、储存、稳定性

试剂盒组成	保存	100 次（NP05012）	200 次（NP05013）
RNase A (10mg/mL)	-20℃	500 μL	1mL
缓冲液 AP1	室温	50 mL	100 mL
缓冲液 AP2	室温	20 mL	40 mL
缓冲液 AP3/E	室温	25 mL 第一次使用前用无水乙醇稀释至 125mL	25mL×2 第一次使用前用无水乙醇稀释至 125mL
漂洗液 WB	室温	25mL 第一次使用前用无水乙醇稀释至 125mL	25mL×2 第一次使用前用无水乙醇稀释至 125mL
洗脱缓冲液 EB	室温	15 mL	25 mL
吸附柱 NE 收集管（2mL）	室温	100 个	200 个

本试剂盒在室温储存 24 个月不影响使用效果。

储存事项

缓冲液 AP1、AP3/E 低温时可能出现析出和沉淀，可以在 65℃水浴几分钟帮助重新溶解（AP3 加入乙醇前可加热，加入乙醇后不可加热），恢复澄清透明后冷却到室温即可使用。

避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、pH 值变化，各溶液使用后应及时盖紧盖子。

产品介绍

该试剂盒采用 DNA 吸附柱和新型独特的溶液系统，适合于从含酚类、多糖类和酶抑制物的植物样品中快速简单地提取基因组 DNA。可在 30 分钟内完成一个或多个 100mg 新鲜或 20mg 干燥的植物样品 DNA 的纯化工作。提取过程不需要用到有毒的酚氯仿等有机物抽提，也不需要用到耗时的异丙醇或乙醇沉淀，并能快速高效地去除多糖类、酚类和酶抑制物等杂质，纯化的 DNA 可直接用于 PCR、酶切和杂交等实验。

新鲜或干燥的植物组织（细胞）磨碎后经裂解液裂解；蛋白质、多糖、细胞残片被沉淀去除；然后基因组 DNA 在高离序盐状态下选择性吸附于离心柱内硅基质膜，再通过一系列快速的漂洗- 离心的步骤 , 进一步将多糖，多酚和细胞代谢物，蛋白等杂质去除，最后低盐的洗脱缓冲液将纯净基因组 DNA 从硅基质膜上洗脱。

产品特点

· 离心吸附柱内硅基质膜全部采用进口特制吸附膜，柱与柱之间吸附量差异极小，可重复性好。克服了国产试剂盒膜质量不稳定的弊端。

· 不需要使用有毒的苯酚等试剂，也不需要乙醇沉淀等步骤。

· 快速，简捷，单个样品操作一般可在 1 小时内完成。

· 数种去多糖、多酚成份和多次柱漂洗确保高纯度， OD260/OD280 典型的比值达 1.7 ～ 1.9，可直接用于 PCR，Southern-blot 和各种酶切反应。

注意事项

》所有的离心步骤均在室温完成，使用转速可以达到 13，000 rpm 的传统台式离心机，如 Eppendorf 5415C 或者类似离心机。

》开始实验前将需要的水浴先预热到 65℃备用。

》缓冲液 AP3/E 中含有刺激性化合物，操作时要戴乳胶手套，避免沾染皮肤，眼睛和衣服。若沾染皮肤、眼睛时，要用大量清水或者生理盐水冲洗。

》不同来源的植物组织材料中提取 DNA 的量会有差异，一般 100mg 新鲜组织典型产量可达 3-25μg。

》洗脱液 EB 不含有螯合剂 EDTA，不影响下游酶切、连接等反应。也可以使用水洗脱，但应该确保 pH 大于 7.5， pH 过低影响洗脱效率。用水洗脱 DNA 应该保存在 -20℃。DNA 如果需要长期保存，可以用 TE 缓冲液洗脱（10mM Tris-HCl， 1mM EDTA，pH 8.0），但是 EDTA 可能影响下游酶切反应，使用时可以适当稀释。

操作步骤（实验前请先阅读注意事项）

提示：第一次使用前请先在漂洗液 WB 中加入指定量无水乙醇，充分混匀，加入后请及时在方框打钩标记已加入乙醇，以免多次加入 !

第一次使用前请先在缓冲液 AP3/E 中加入指定量无水乙醇 !

1. 取适量植物组织（新鲜组织 100 mg 或干重组织 20 mg，可适当多取一些样品弥补粘在研钵上的损失）在研钵中加入液氮充分碾磨成细粉。

研磨前，可准备一个 1.5mL 离心管，加入 400μL 缓冲液 AP1 和 4μL RNase A(10 mg/ mL) 室温备用。

2. 转移细粉（新鲜组织 100 mg 或干重组织 20 mg）到前面准备的 1.5mL 离心管（已加入 400μL 缓冲液 AP1 和 4μL RNase A(10 mg/mL) 旋涡振荡，充分混匀帮助裂解。

如果组织裂解困难，可根据需要加一个轻柔匀浆 10 秒的步骤帮助裂解。大多数情况下不需要离心去除未完全裂解的组织，因为后面有一个离心去除的步骤。

3. 65℃水浴 10 分钟，在水浴过程中颠倒离心管 2-3 次，混合样品。

4. 加入 130 μL 缓冲液 AP2，充分混匀，冰上放置 5 分钟， 14,000 rpm 离心 5-10 分钟，小心吸取上清到一个新的 1.5mL 离心管，注意不要吸到界面物质。

5. 计算上清量，加入 1.5 倍体积的 AP3/E（请先检查是否已加入无水乙醇 !），立即吹打混匀。

加入 AP3/E 可能会出现絮状沉淀，但不影响 DNA 提取。注意将 AP3/E 直接加入到上清并立即吹打混匀。

6. 将上一步所得混合物（包括可能出现的沉淀）加入一个吸附柱 NE 中，（吸附柱放入收集管中）13,000 rpm 离心 30-60 秒，倒掉收集管中的废液（先加 650μL 离心，弃废液，再加入剩余的溶液，再次离心）。

7. 加入 600μL 漂洗液 WB（请先检查是否已加入无水乙醇 !），12,000 rpm 离心 30 秒，弃掉废液。

8. 加入 600μL 漂洗液 WB，12,000 rpm 离心 30 秒，弃掉废液。

9. 将吸附柱 NE 放回空收集管中，13,000 rpm 离心 2 分钟，尽量除去漂洗液，以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。

10. 取出吸附柱 NE，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加 100μL 洗脱缓冲液 EB（洗脱缓冲液可事先在 65-70℃水浴中预热），室温放置 3-5 分钟，12,000 rpm 离心 1 分钟。将得到的溶液重新加入吸附柱中，室温放置 2 分钟，12,000 rpm 离心 1 分钟。

洗脱体积越大，洗脱效率越高，如果预计和需要产量高，可增大洗脱体积，如果需要 DNA 浓度较高，可以适当减少洗脱体积，但是最小体积不应少于 50μL，体积过小降低 DNA 洗脱效率，减少 DNA 产量。

11. DNA 可以存放在 2-8℃ , 如果要长时间存放，可以放置在 -20℃。

问题与解决方法

问题	评论与建议
DNA 产量低	* 处理材料过量或者裂解不完全 - 建议：使用适量的起始材料，充分研磨或者匀浆 * 结合条件不恰当 - 建议：步骤 5 精确估计上清量，加入 1.5 倍体积 AP3/E 量要准确
RNA 残留	* 植物 RNA 含量太丰富 - 建议：提高 RNase A 处理浓度
未提取到 DNA	* 漂洗液 WB 中忘记加无水乙醇 - 建议：第一次实验时，在漂洗液 WB 中加入指定量无水乙醇。
离心柱堵塞	* 研磨裂解不充分，团块多；裂解物太粘稠；离心力太小 - 建议：参见步骤 2，加一个离心步骤去除；减低起始材料量，不要处理过量，加大离心力
洗脱下来的 DNA 溶液带颜色或者膜上有明显的色素残留	* 漂洗次数不够 - 建议：步骤 8 完成后，加 500μL 乙醇再漂洗一遍 * 起始材料太多过量 - 建议：减少起始处理材料，不要过量
洗脱下来的 DNA 产量低	* 离心柱残留有较多乙醇或者底部不慎沾有乙醇 - 建议：确保做了步骤 9，否则残留乙醇会影响洗脱效率。 * 使用了水或者其它非最佳液体代替洗脱缓冲液 - 建议：仔细阅读步骤 10 和注意事项 5 和只使用洗脱缓冲液 EB 洗脱。 * 洗脱缓冲液量偏低 - 建议：使用 200μL 洗脱缓冲液洗脱
A260 吸光值异常偏高	* 一些硅基质膜成分一起洗脱下来，干扰了吸光值 - 建议：将洗脱的基因组 DNA 溶液 13,000rpm 再离心一分钟，小心取上清使用。
DNA 下游酶切不能切开或者酶切不完全	* 一些硅基质膜成分一起洗脱下来，抑制了酶切反应 - 建议：将洗脱的基因组 DNA 溶液 13,000rpm 再离心一分钟，小心取上清使用。 * 离心柱残留有较多乙醇或者底部不慎沾有乙醇抑制了酶切反应 - 建议：确保做了步骤 9，然后空气中晾几分钟，让残留乙醇挥发。