넳 넲

组织/细胞RNA快速提取试剂盒

ꄴ前一个： Plant microRNA Kit 植物microRNA快速提取试剂盒

货号	次数
NP06011	50次

适用范围

适用于快速提取普通动物细胞和易裂解动物组织总 RNA，使用独有基因组 DNA 清除柱技术确保有效清除 gDNA 残留，不需要使用 DNase 消化，RNA 可直接用于反转录荧光定量 PCR.，Northern-blot 等下游实验。

试剂盒组成、储存、稳定性

试剂盒组成	保存	50 次（NP06011）
裂解液 RLT Plus	室温	50 mL
去蛋白液 RW1	室温	40 mL
漂洗液 RW	室温	10mL 第一次使用前用无水乙醇稀释至 50mL
RNase-free H2O	室温	10 mL
70% 乙醇	室温	9mL RNase-free H2O 第一次使用前用无水乙醇稀释至 30mL
基因组清除柱 DNANE 和收集管	室温	50 套
RNase-free 吸附柱 RNANE 和收集管	室温	50 套

本试剂盒在室温储存 24 个月不影响使用效果。

存储事项

所有的溶液应该是澄清的，如果环境温度低时溶液可能形成沉淀，此时不应该直接使用，可在 37℃水浴加热几分钟，即可恢复澄清。

不合适的储存于低温（4℃或者－ 20℃)会造成溶液沉淀，影响使用效果，因此运输和储存均在室温下（15℃- 25℃)进行。

避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、PH 值变化，各溶液使用后应及时盖紧盖子。

产品介绍

该基因组 DNA 清除柱技术确保有效清除 gDNA 残留，得到的 RNA 不需要 DNase 消化，可直接用于反转录 PCR、荧光定量 PCR 等实验。独特的裂解液迅速裂解细胞和灭活细胞 RNA 酶，然后裂解混合物通过一个基因组 DNA 清除柱，基因组 DNA 被清除而 RNA 穿透滤过。滤过的 RNA 用乙醇调节结合条件后，RNA 在高离序盐状态下选择性吸附于离心柱内硅基质膜，再通过一系列快速的漂洗－离心的步骤 , 去蛋白液和漂洗液将细胞代谢物，蛋白等杂质去除，最后低盐的 RNase free H20 将纯净 RNA 从硅基质膜上洗脱。

产品特点

·完全不使用有毒的苯酚，氯仿，Beta 巯基乙醇等试剂，也不需要乙醇沉淀等步骤。

·快速，简捷，单个细胞样品操作一般可在 15 分钟内完成。

· 独家研发成功基因组 DNA 清除柱技术确保有效清除 gDNA 残留，得到的 RNA 不需要 DNase 消化，可直接用于反转录 PCR、荧光定量 PCR 等实验。

·多次柱漂洗确保高纯度，OD260/OD280 典型的比值达 2.1-2.2（100% 纯的 RNA 比值一般是 2.2 左右，很多公司的产品因为残留蛋白或者 DNA 较多，造成比值降低，无法达到 2.2 这个纯度标准，因此降低要求 1.9-2.0 就凑合使用了，但是我们的产品标准一般可以达到高水准的 2.1-2.2 的纯度标准）。

注意事项

》所有的离心步骤均在室温完成，使用转速可以达到 13,000 rpm 的台式离心机即可。

》样品处理量绝对不要超过基因组吸附柱 DNANE 和和 RNA 吸附柱 RNANE 处理能力，否则造成 DNA 残留或者产量降低。不同组织细胞种类 RNA/DNA 相差极大，例如胸腺脾脏 DNA 含量丰富，超过 5mg 就会超过柱子处理能力。COS 细胞 RNA 含量丰富，超过 3x106 细胞就会超过柱子吸附能力。所以开始摸索实验条件时，如果不清楚样品 DNA/RNA 含量时宁可使用较少的样品处理量，如细胞不超过 3-4x106，组织不超过 10mg。将来根据样品试验情况增加或者减少处理量。

》裂解液 RLT Plus 和去蛋白液 RW1 中含有盐酸胍 / 异硫氰酸胍化合物，操作时要戴乳胶手套，避免沾染皮肤，眼睛和衣服。若沾染皮肤、眼睛时，要用大量清水或者生理盐水冲洗。

》预防 RNase 污染，应注意以下几方面：

1) 经常更换新手套。因为皮肤经常带有细菌，可能导致 RNase 污染。

2) 使用无 RNase 的塑料制品和枪头避免交叉污染。

3) RNA 在裂解液 RLT Plus 中时不会被 RNase 降解。但提取后继续处理过程中应使用不含 RNase 的塑料和玻璃器皿。玻璃器皿可在 150℃烘烤 4 小时，塑料器皿可在 0.5 M NaOH 中浸泡 10 分钟，然后用水彻底清洗，再灭菌，即可去除 RNase。

4) 配制溶液应使用无 RNase 的水。（将水加入到干净的玻璃瓶中，加入 DEPC 至终浓度 0.1%( v/v)，37℃放置过夜，高压灭菌。）

》关于 DNA 的微量残留：

一般说来任何总 RNA 提取试剂在提取过程中无法完全避免 DNA 的微量残留（DNase 消化也无法做到 100% 无残留），该产品由于采取了本公司独特的缓冲体系和基因组 DNA 清除柱技术，绝大多数 DNA 已经被清除，不需要 DNase 消化，可直接用于反转录 PCR 和荧光定量 PCR。个别特殊情况如 DNA 含量过于丰富造成残留或者要进行严格的 mRNA 表达量分析荧光定量 PCR，我们建议在进行模板和引物的选择时：

1) 选用跨内含子的引物 , 以穿过 mRNA 中的连接，这样 DNA 就不能作为模板参与扩增反应。

2) 选择基因组 DNA 和 cDNA 上扩增的产物大小不一样的引物对。

3) 将 RNA 提取物用 RNase-free 的 DNase I 处理以提高效果。

4) 在步骤去蛋白液 RW1 漂洗前，直接在吸附柱 RNANE 上进行 DNase I 处理。

》 RNA 纯度及浓度检测：

完整性： RNA 可用普通琼脂糖凝胶电泳 ( 电泳条件：胶浓度 1.2%；0.5×TBE 电泳缓冲液； 150v，15 分钟 ) 检测完整性。由于细胞中 70%-80% 的 RNA 为 rRNA，电泳后 UV 下应能看到非常明显的 rRNA 条带。动物 rRNA 大小分别约为 2 kb 和 1kb，分别相当于 28S 和 18S rRNA。动物 RNA 样品中最大 rRNA 亮度应为次大 rRNA 亮度的 1.5-2.0 倍，否则提示 RNA 样品的降解。出现小的弥散片状或条带消失表明样品严重降解。但是应该注意区分是提取出来的 RNA 样品本身降解了，还是提取出来的 RNA 是完好的，只是在电泳过程中降解的。

纯度： OD260/OD280 比值是衡量蛋白质污染程度的参考指标。高质量的 RNA，OD260/ OD280 读数在 2.1-2.2 之间 100% 纯的 RNA 比值一般是 2.2 左右（100% 纯的 RNA 比值一般是 2.2 左右，很多公司的产品因为残留蛋白或者 DNA 较多，造成比值降低，无法达到 2.2 这个纯度标准，因此降低要求 1.9-2.0 就凑合使用了，但是核小体的产品标准一般可以达到高水准的 2.1-2.2 的纯度标准）。OD260/OD280 读数受测量使用的机器影响，也受测定所用稀释溶液的 pH 值影响。微量分光光度计一般不需要稀释，不受稀释溶液的 PH 值影响。但是同一个 RNA 样品，如果测量的时候机器要求稀释后测量，假定在 10mM Tris，pH7.5 稀释溶液中测出的 OD260/OD280 读数 1.9-2.1 之间，在水溶液中所测读数则可能在 1.5-1.9 之间，但这并不表示 RNA 不纯。

浓度：取一定量的 RNA 提取物，用 RNase-free 水稀释 n 倍，用 RNase-free 水将分光光度计调零，取稀释液进行 OD260, OD280 测定，按照以下公式进行 RNA 浓度的计算：终浓度（ng/μL）= (OD260)×( 稀释倍数 n)×40。

操作步骤（实验前请先阅读注意事项）

提示：第一次使用前请先在漂洗液 RW 瓶和 70% 乙醇瓶中加入指定量无水乙醇 !

1. 培养细胞

A1. 贴壁细胞：不需消化，彻底吸干净培养液体后直接加推荐量裂解液 RLT Plus（见附录一）反复吹打细胞裂解，取裂解后的匀浆液全部加到 DNA 清除柱 DNANE 上（清除柱放在收集管内）直接接操作步骤 3；不方便直接裂解的培养容器，可以用细胞刮子刮下细胞，或者胰蛋白酶消化后吹打下来收集细胞到 1.5mL 离心管。

A2. 悬浮细胞：收集 <107 悬浮细胞到一个 1.5mL 离心管。

B. 13， 000rpm 离心 10 秒（或者 300g 离心 5 分钟），使细胞沉淀下来。完全吸弃上清，留下细胞团，注意不完全弃上清会稀释裂解液导致产量纯度降低。

C. 轻弹离心管底部，使细胞沉淀松散，加 350μL（<5x106 细胞）或 600μL（5x106-1x107 细胞）裂解液 RLT Plus，用移液器反复吹打充分裂解 ( 直到看不细胞团为止 )。

D. 将裂解混合物全部加到 DNA 清除柱 DNANE 上（清除柱放在收集管内）。 E. 立刻接操作步骤 3。

2. 动物组织（例如鼠肝脑）

A1. 匀浆器匀浆：新鲜组织加入 350μL(<20mg 组织 ) 或者 600μL(20-30mg 组织 ) 的裂解液 RLT Plus 后玻璃匀浆器或电动匀浆器将组织彻底研磨匀浆。

A2. 液氮研磨 + 匀浆：在液氮中研磨组织成细粉后，取适量组织细粉 (20mg/30mg) 转入装有 350μL/600μL 组织裂解液 RLT Plus 的 1.5mL 离心管中 , 剧烈振荡 20 秒，难裂解样品可用移液器反复吹打匀浆。

注意：若研磨匀浆后不溶物碎片太多，可将匀浆后裂解物 13，000rpm 离心 3 分钟沉淀可能存在的裂解困难的碎片或者不溶物。将上清液加到 DNA 清除柱 DNANE 上（清除柱放在收集管内）。

B. 将研磨均匀的匀浆液全部加到 DNA 清除柱 DNANE 上（清除柱放在收集管内）。 C. 立刻接操作步骤 3。

3. 立刻 13,000 rpm 离心 1 分钟，保留滤过液（RNA 在滤过液中）。

确保离心后液体全部滤过去，膜上没有残留，如有必要，可以加大离心力和离心时间。

4. 较精确估计滤过液体积（通常为 350μL/600μL，滤过时候损失体积应该减去，可用移液器吸取滤液估计体积），加入等体积的 70% 乙醇（请先检查是否已加入无水乙醇 !），此时可能出现沉淀，但是不影响提取过程，立即吹打混匀，不要离心。

5. 立刻将混合物 ( 每次小于 720μL，多可以分两次加入 ) 加入一个吸附柱 RNANE 中，（吸附柱放入收集管中）13,000 rpm 离心 30 秒，弃掉废液。

6. 加 700μL 去蛋白液 RW1，室温放置 30 秒，13，000rpm 离心 30 秒，弃掉废液。

7. 加入 500μL 漂洗液 RW（请先检查是否已加入无水乙醇 !）， 13,000 rpm 离心 30 秒，弃掉废液。加入 500μL 漂洗液 RW，重复一遍。

8. 将吸附柱 RNANE 放回空收集管中， 13,000 rpm 离心 2 分钟，尽量除去漂洗液，以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。

9. 取出吸附柱 RNANE，放入一个干净 1.5mL 离心管中，根据预期 RNA 产量在吸附膜的中间部位加 30-50μL RNase free water，室温放置 1 分钟，1,3,000 rpm 离心 1 分钟得到 RNA 溶液。

洗脱缓冲液体积不应少于 30 μL，体积过小影响回收效率。如果需要得到更大浓度的 RNA，将离心得到的 RNA 溶液加回到吸附柱重复洗脱一遍。

附录一：贴壁培养细胞数量表

培养器皿	底面积（cm2 ）	加培养液量（mL）	可获细胞量
24 孔培养板	2	1.0	5×105
6 孔培养板	9.6	2.5	2.5×106
3.5cm 培养皿	8	3.0	2.0×106
6cm 培养皿	21	5.0	5.2×106
25cm 塑料培养瓶	25	5.0	5.2×106
100mL 玻璃培养瓶	33	10.0	7×106