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零背景 pTOPO- 粘末端克隆试剂盒

零背景 pTOPO- 粘末端克隆试剂盒
货号 次数
NC04010 20次
NC04011 80次

 

 

试剂盒组成、储存、稳定性

 

试剂盒组成

保存

20 

NC04010

80 

NC04011

pTOPO-T Simple Vector(30ng/μL)

-20℃

20 μL

80μL

1000bp Control30ng/μL)

-20℃

5μL

5μL

10 × Enhancer

-20℃

20 μL

80μL

 

储存事宜

- 20℃储存,至少 12 个月。冰袋运输,1-2 天置于室外常温不影响质量。

产品介绍

本制品和传统的 T4 连接酶原理不同,它利用了 Topoisomerase 可以在瞬间(几秒钟 -几分钟)、高效(接近 100%)连接 DNA 片段的原理采用本公司特殊的工艺制成。

产品特点

1. 可以在瞬间(几秒钟 - 几分钟)完成 A 末端 PCR 产物连接。

2. 特制的新型载体质粒大小仅仅不到 2kb,充分发挥了 TOPO 载体越小,可容纳片段越 大的优势,最大限度提高了大片段连接效率;连接后质粒大小比传统载体小 2kb 以上,质粒越小,转化效率越高,极大的提高了各种片段连接后的转化子数量。

3. 采用氨苄抗性载体只需 10 分钟复苏时间,比卡那抗性载体 1 小时复苏时间缩短 6 倍。

4. 最快可以不用冰浴和热休克,  室温 5 分钟内完成转化;无需 1 小时复苏,  只需 37℃ 10分钟复苏便可以涂板。从连接到涂板最快只需 15-20 分钟。

5. 自杀基因零背景原理,无自连假阳性,无需繁琐蓝白斑筛选和菌落 PCR 筛选。大部分情况下随机挑一个克隆便是有插入的(接近 100%)。

6. 连接长片段能力远超传统 TA 克隆载体,  可连接长达 10kb 片段(例如连接 5kb 片段, 也可能达到挑 10 个菌落,至少 8 个是有插入的效果 是新一代世界领先的简单、快速、零背景免筛选的 TOPO TA 克隆载体。

本制品在克隆插入位点两侧不含多克隆酶切位点(Simple 需要时可在 PCR 扩增引 物上导入合适的酶切位点。此时如果使用 PCR 扩增引物导入的酶切位点进行酶切时,酶切反应将不会受到载体上其它多克隆酶切位点影响,可大大提高酶切效率,增加亚克隆成功率。

注意: 测序 只能 采用 M13F/M13R 通用引 物测 序(见 后面 图谱), 但是 不能 采用M13(-47)/M13(-48) 通用引物测序。菌落 PCR 可使用和测序相同的引物。

操作步骤

1. 连接反应的准备:

PCR 引物使用正常设计的引物即可,不需做任何改变(不能用磷酸化引物)。使用能  PCR 产物末端加  个突出的 3’-A的     增(如 TaqLA TaqF8 MixTaq Mix)  PCR 产物一般建议胶回收纯化,  这样可以避免后续可能的问题。如果 PCR 产物仅有 目的条带、无非特异条带和引物二聚体,也可尝试直接进行连接反应。如果是以质粒为模板的PCR 产物则最好进行纯化,因为模板质粒也可能长出菌落(但不是想构建的目的载体)。

2. 连接反应:

1) 室温(25℃ -37℃)设立 10μL 连接体系(建议 0.2mL PCR 管, PCR 仪器控温):

纯化后的 PCR 产物 / 或者 1μL 1000bp control

0.5-5μL

pTOPO-TA Simple Vector

1μL

10  × Enhancer

1μL

灭菌水

XμL

总体积

10μL

 

加完试剂后,用移液器轻轻吹打混匀或者轻弹管底混匀,低速瞬时离心收集所有液体在离心管底, 注意此步骤不能在冰上进行,只能在室温(25℃ -37℃)进行。

注:如果使用 5μL 体系连接,各成分按照比例减半使用,使用次数可以加倍。不同大小插入片段的推荐用量(注意过量太多了,反而导致转化子减少):

插入片段大小(bp)

推荐用量(ng)

100-1000

10-40

1000-2000

40-80

2000-5000

80-180

2) 室温(25℃ -37℃)连接 5 分钟(建议置 PCR 仪器上控温)。

本载体推荐室温(25℃ -37℃) 5 分钟完成连接。长片段或者连接困难片段可以延长连接时间到 10-15 分钟,温度可选 37℃,可显著增加转化子数量。

3) 连接产物置于冰上备用。立即接标准的感受态转化步骤或者快速转化步骤。

3. 快速转化:

1) 感受态细胞从 -80℃拿出,迅速插入冰浴中,解冻融化( 1-3 分钟左右)。

2) 立刻加入 5μL 连接液 ( 最多可全部加入,只要体积不超过感受态细胞体积的 1/10),用手拨打离心管底轻轻混匀 ( 避免用枪吸打 ),冰浴放置 5 分钟。

3)42℃水浴热激 60 秒,迅速放回冰浴静置 2-3 分钟,该过程不要摇动离心管。

注意:此步骤首选建议 42℃水浴 60 秒热激。但是根据我们的经验,大部分商品化  TOP10 和 DH5a 感受态细胞此步骤也可将离心管置于室温(> 22℃) 行,时间不需十分  准确,夏季或室温较高时,可放置 5-8 分钟左右;如果室温较低,可延长时间至 8-15 分钟左右。

有经验的客户可以根据具体情况尝试无热激转化。

4) 加 500l LB 或者 SOC 培养基 ( 不含抗生素 ),37℃ 200 rpm 振荡培养 10-20 分钟。

根据我们的经验,一般可以直接将培养基(如从冰箱取出温度低,应事先置 37℃温箱回 温至 22℃ -37℃)  加入到感受态细胞的 1.5 mL 离心管,盖上离心管盖,水平固定在振荡培养箱中振荡培养复苏即可,不需要转移到试管培养复苏。

一般商品化的感受态细胞不超过 2kb 插入片段情况下,热休克后 10-15 分钟复苏可以得 到足够多转化子,如果使用实验室自制的感受态效率低、或者转化子少、插入片段长的情况下可以提高复苏时间到 30-60 分钟以得到更多的转化子。

5) 取 100-200μL 菌液涂板 ( 培养板含氨苄青霉素 100 μg/mL),  培养过夜。(如果 预计转化子少,为得到较多克隆,4000 rpm 离心 1 min,吸弃掉部分上清,保留 100μL,轻弹悬浮菌体,取全部菌液涂板)

4. 转化子的筛选鉴定:

本制品采用自杀基因零背景原理,无插入自连的细菌会自杀无法生长,因此几乎没有 假阳性,一般情况下,可以达到所见即所得,只要是长出来的菌落正常(不是污染的杂菌,  转化子数量也不算太少 基本就包含插入。因此插入片段不超过 2-3kb 的情况下可以不用菌落 PCR 鉴定 , 直接挑 1-2 个菌去测序。

1). 一般本公司 TOPO 载体阳性率非常高,所以菌落生长正常,数量也不是太少的情 况下建议省略菌落 PCR/ 菌液 PCR 鉴定直接去测序。注意测序引物不能采 M13(-47)/M13(-48) 通用引物测序。

2).TOPO 载体的菌落 PCR 结果容易出现假阴性。因此在使用菌落 PCR 鉴定的情况下, 如菌落 PCR 结果阳性,一般可以相信此结果。如结果是阴性,或者显示扩增出大小和预期  不符合,一般不可相信,要考虑到菌落 PCR 结果假阴性的可能。需要进一步提取质粒电泳跑大小,或者酶切鉴定来确认。

3). 用上述培养的白色菌落的菌液抽提质粒,插入片段较大的情况下,直接跑电泳看质 粒大小就直接能鉴定出有插入的质粒,还可用载体骨架上酶切位点如 ApaI/BglI/BsaHI,或 者插入片段上引入的酶切位点酶切鉴定,琼脂糖凝胶电泳检查片段大小,确定是否含有目的片段。

 
说明书:
 
 
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