T4 DNA Ligase ( T4 DNA 快速连接酶)
| 货号 | 规格 |
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NE01041
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1000u/支 |
试剂盒组成、储存、稳定性
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试剂盒组成 |
保存 |
NE01041 |
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T4 DNA Ligase（Fast） |
-20℃ |
5U/ μL,1000U |
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10× T4 DNA Ligase Buffer |
-20℃ |
1mL |
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50% PEG |
-20℃ |
1mL |
注：1 U = 1 Weiss unit
产品介绍
T4 DNA Ligase（Fast) 由携带 T4 噬菌体 gene 30 的大肠杆菌产生。该酶催化双螺旋 DNA 或 RNA 之间的 5'- 磷酸基团和 3'- 羟基之间形成磷 酸二酯键。该酶在双链 DNA、RNA 或者 DNA/ RNA 复合物间可修复单链 缺刻 , 并且可以连接有粘性末端或者平末端的 DNA 片段，但对于单链核 酸无活性，主要用于限制性内切酶酶切产物 DNA 片段克隆、基因定点突 变与 PCR 产物克隆、修复 双链 DNA 缺刻与线性 DNA 自环化。T4 DNA Ligase（Fast) 需要 ATP 作为辅助因子， 在室温下 完成粘性末端连接反应仅需 10 分钟。
酶活单位定义
37℃条件下，1 Weiss unit 的酶在 20 min 内催化 1 nmol 的 [32PPi] 转变为活性炭吸附态。1 Weiss unit 等同于约 200 个粘性末端连接反应单位（CEU），相当于在 16℃条件下，30 min 内连 接 50% HindIII 消化后的 λDNA 片段。
酶活监测条件
酶活在如下反应混合物中进行测试：66 mM Tris-HCl (pH 7.6)，6.6 mM MgCl2 ，0.066 mM ATP，10 mM DTT，3.3 μM [32PPi]。
质量控制
核酸内切酶残留测试
37℃条件下，将 200 U 的 T4 DNA Ligase（Fast) 与 1 μg 的 pUC19 DNA 中温育 4 h，未 检测出由共价闭合环状 DNA 转变为带有缺刻的 DNA。
核酸外切酶残留检测
将酶液与双链 DNA 底物在 37℃温育 16 h，通过 DNA 电泳检测双链 DNA 底物无变化。
蓝白斑测试
室温条件下， 使用 30 U T4 DNA Ligase（Fast) 连接 pUC57 DNA/HindIII，pUC57 DNA/ PstI 及 pUC57 DNA/SmaI 消化产物 1 h， 然后用 E.coli XL1-Blue 感受态细胞转化连接产物， 检 测到少于 1% 的白斑。
使用方法
1. DNA 插入片段连接至载体 DNA（粘性末端连接）
① 于冰上配制如下反应体系：
② 充分混匀并瞬离，22℃温育 10 min；
③ 取 1~5 μL 的连接产物用于 50 μL 化学感受态细胞的转化，或者取 1~2μL 用于 50 μL 电 转感受态细胞的转化。
注：10× T4 DNA Ligase Buffer 在融解时，如果出现少量沉淀属正常现象，请颠倒混匀 或置于冰上融解后使用。
注：如果连接反应产物用于电转化，应使用离心柱或者氯仿抽提清洁 DNA 代替热失活步骤。
2. DNA 插入片段连接至载体 DNA（平末端连接）
① 于冰上配制如下反应体系：
②充分混匀并瞬离，22℃温育 1 h；
③ 取 1~5 μL 的连接产物用于 50 μL 化学感受态细胞的转化，或者取 1~2μL 用于 50 μL 电 转感受态细胞的转化。
注：如果连接反应产物用于电转化，应使用离心柱或者氯仿抽提清洁 DNA 代替热失活步骤。
3. 线性 DNA 自环化
① 于冰上配制如下反应体系：
② 彻底混匀并瞬离，22℃温育 10 min；
③ 在 65℃作用 10 min 或者 70℃作用 5 min，进行热失活。
注：如果连接反应产物用于电转化，应使用离心柱或者氯仿抽提清洁 DNA 代替热失活步骤。
4. 接头连接
双链寡核苷酸接头经常被用于在插入片段上产生粘性末端。接头通常包含限制酶识别位点，在连 接后经酶切处理产生和克隆载体匹配的粘端。有时候接头已包含与克隆载体匹配的粘端，此时无需在 接头连接完成后进行插入片段的进一步处理。
① 于冰上配制如下反应体系：
② 彻底混匀并瞬离，22℃温育 10 min；
③ 在 65℃作用 10 min 或者 70℃作用 5 min，进行热失活。
- mL
