零背景 pTOPO- 平末端克隆试剂盒
| 货号 | 次数 |
| NC06010 | 20次 |
| NC06011 | 80次 |
试剂盒组成、储存、稳定性
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试剂盒组成 |
保存 |
20 次 NC06010 |
80 次 NC06011 |
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pTOPO-Blunt Simple Vector(30ng/μL) |
-20℃ |
20 μL |
80μL |
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1kb Control（40ng/μL) |
-20℃ |
5μL |
5μL |
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10 × Enhancer |
-20℃ |
20 μL |
80μL |
储存事宜
- 20℃储存，至少 12 个月。冰袋运输，1-2 天置于室外常温不影响质量。
产品介绍
本制品和传统的 T4 连接酶原理不同，它利用了 Topoisomerase 可以在瞬间（几秒钟 -几分钟）、高效（接近 100%）连接 DNA 片段的原理采用本公司特殊的工艺制成。
产品特点
1. 平末端 PCR 产物不需要先加 A，在瞬间（几秒钟 - 几分钟）完成平末端 PCR 产物连接。
2. 特制的新型载体质粒大小仅仅不到 2kb，充分发挥了 TOPO 载体越小，可容纳片段越 大的优势，最大限度提高了大片段连接效率；连接后质粒大小比传统载体小 2kb 以上，质粒越小，转化效率越高，极大的提高了各种片段连接后的转化子数量。
3. 采用氨苄抗性载体只需 10 分钟复苏时间，比卡那抗性载体 1 小时复苏时间缩短 6 倍。
4. 最快可以不用冰浴和热休克， 室温 5 分钟内完成转化；无需 1 小时复苏， 只需 37℃ 10
分钟复苏便可以涂板。从连接到涂板最快只需 15-20 分钟。
5. 自杀基因零背景原理，无自连假阳性，无需繁琐蓝白斑筛选和菌落 PCR 筛选。大部分
情况下随机挑一个克隆便是有插入的（接近 100%）。
6. 连接长片段能力远超传统 Blunt 克隆载体， 可连接长达 10kb 片段（例如连接 5kb 片段， 也可能达到挑 10 个菌落，至少 8 个是有插入的效果） ，是新一代世界领先的简单、快速、零背景免筛选的 TOPO Blunt 平末端克隆载体。
本制品在克隆插入位点两侧不含多克隆酶切位点（Simple） ，需要时可在 PCR 扩增引 物上导入合适的酶切位点。此时如果使用 PCR 扩增引物导入的酶切位点进行酶切时，酶切反应将不会受到载体上其它多克隆酶切位点影响，可大大提高酶切效率，增加亚克隆成功率。
注意：测 序只能 采用 M13F/M13R 通用引 物测 序（见 后面 图谱）， 但是 不能 采用M13(-47)/M13(-48) 通用引物测序。菌落 PCR 可使用和测序相同的引物。
操作步骤
1. 连接反应的准备：
PCR 引物使用正常设计的引物即可，不需做任何改变（不能用磷酸化引物） 。使用扩增 产物是平末端的高保真聚合酶系列扩增（如 Pfu、Phusion、A8 Mix、A9 Mix）PCR 产 物一般建议胶回收纯化，这样可以避免后续可能的问题。如果 PCR 产物仅有目的条带、无非 特异条带和引物二聚体，也可尝试直接进行连接反应。如果是以质粒为模板的 PCR 产物则最好进行纯化，因为模板质粒也可能长出菌落（但不是想构建的目的载体）。
2. 连接反应：
1) 室温（25℃ -37℃) 设立 10μL 连接体系（建议用 0.2ml PCR 管， PCR 仪器控温）：
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纯化后的 PCR 产物 / 或者 1μL1kb control |
0.5-5μL |
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pTOPO-BLUNT Simple Vector |
1μL |
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10 × Enhancer |
1μL |
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灭菌水 |
XμL |
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总体积 |
10μL |
加完试剂后，用移液器轻轻吹打混匀或者轻弹管底混匀，低速瞬时离心收集所有液体在离心管底 , 注意此步骤不能在冰上进行，只能在室温（25℃ -37℃)进行。
注：如果使用 5μL 体系连接，各成分按照比例减半使用，使用次数可以加倍。不同大小插入片段的推荐用量（注意过量太多了，反而导致转化子减少）：
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插入片段大小（bp） |
推荐用量（ng） |
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100-1000 |
10-40 |
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1000-2000 |
40-80 |
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2000-5000 |
80-180 |
2) 室温（25℃ -37℃)连接 5 分钟（建议置 PCR 仪器上控温）。
本载体推荐室温（25℃ -37℃) 5 分钟完成连接。长片段或者连接困难片段可以延长连
接时间到 10-15 分钟，温度可选 37℃,可显著增加转化子数量。
3) 连接产物置于冰上备用。立即接标准的感受态转化步骤或者快速转化步骤。
3. 快速转化：
1) 感受态细胞从 -80℃拿出，迅速插入冰浴中，解冻融化（约 1-3 分钟左右）。
2) 立刻加入 5μL 连接液 ( 最多可全部加入，只要体积不超过感受态细胞体积的 1/10)，
用手拨打离心管底轻轻混匀 ( 避免用枪吸打 )，冰浴放置 5 分钟。
3)42℃水浴热激 60 秒，迅速放回冰浴静置 2-3 分钟，该过程不要摇动离心管。
注意：此步骤首选建议 42℃水浴 60 秒热激。但是根据我们的经验，大部分商品化的 TOP10 和 DH5a 感受态细胞此步骤也可将离心管置于室温（＞ 22℃) 进行，时间不需十分 准确，夏季或室温较高时，可放置 5-8 分钟左右；如果室温较低，可延长时间至 8-15 分钟左右。
有经验的客户可以根据具体情况尝试无热激转化。
4) 加 500lμLLB 或者 SOC 培养基 ( 不含抗生素 )，37℃ 200 rpm 振荡培养 10-20 分钟。
根据我们的经验，一般可以直接将培养基（如从冰箱取出温度低，应事先置 37℃温箱回 温至 22℃ -37℃) 加入到感受态细胞的 1.5 mL 离心管，盖上离心管盖，水平固定在振荡培养箱中振荡培养复苏即可，不需要转移到试管培养复苏。
一般商品化的感受态细胞不超过 2kb 插入片段情况下，热休克后 10-15 分钟复苏可以得 到足够多转化子，如果使用实验室自制的感受态效率低、或者转化子少、插入片段长的情况下可以提高复苏时间到 30-60 分钟以得到更多的转化子。
5) 取 100-200μL 菌液涂板 ( 培养板含氨苄青霉素 100 μg/mL）， 培养过夜。（如果 预计转化子少，为得到较多克隆，4000 rpm 离心 1 min，吸弃掉部分上清，保留 100μL，
轻弹悬浮菌体，取全部菌液涂板）
4. 转化子的筛选鉴定：
本制品采用自杀基因零背景原理，无插入自连的细菌会自杀无法生长，因此几乎没有 假阳性，一般情况下，可以达到所见即所得，只要是长出来的菌落正常（不是污染的杂菌， 转化子数量也不算太少） ，基本就包含插入。因此插入片段不超过 2-3kb 的情况下可以不用菌落 PCR 鉴定 , 直接挑 1-2 个菌去测序。
1). 一般本公司 TOPO 载体阳性率非常高，所以菌落生长正常，数量也不是太少的情 况下建议省略菌落 PCR/ 菌液 PCR 鉴定直接去测序。注意测序引物不能采用 M13(-47)/M13(-48) 通用引物测序。
2).TOPO 载体的菌落 PCR 结果容易出现假阴性。因此在使用菌落 PCR 鉴定的情况下， 如菌落 PCR 结果阳性，一般可以相信此结果。如结果是阴性，或者显示扩增出大小和预期 不符合，一般不可相信，要考虑到菌落 PCR 结果假阴性的可能。需要进一步提取质粒电泳跑大小，或者酶切鉴定来确认。
3). 用上述培养的白色菌落的菌液抽提质粒，插入片段较大的情况下，直接跑电泳看质 粒大小就直接能鉴定出有插入的质粒，还可用载体骨架上酶切位点如 ApaI/BglI/BsaHI，或 者插入片段上引入的酶切位点酶切鉴定，琼脂糖凝胶电泳检查片段大小，确定是否含有目的片段。
