QuantumTech RT Kit (+gDNA Eraser) 反转录试剂盒
货号 | 次数 |
NN01012 | 100次 |
NN01011 | 50次 |
适用范围
第一链 cDNA 合成。可用于高拷贝、低拷贝基因的检测。
试剂盒组成、储存、稳定性
试剂盒组成 |
保存 |
50 次 (NN01011) |
100 次 (NN01012) |
4×gDNA Eraser Mix |
-20℃ |
200 μL |
400 μL |
5×TRUE RT MasterMix II |
-20℃ |
200 μL |
400 μL |
5×No RTase Control Mix* |
-20℃ |
20 μL |
40 μL |
RNase free H2O |
-20℃ |
1 mL |
1 mL |
注:5×No RTase Control Mix* 除 了 不 含 反 转 录 酶, 其 他 成 分 和 5×TRUE RT MasterMix II 完全一致,可以用于反转录的阴性对照。
储存事项
-20℃ 保存,有效期 24 个月
产品介绍
本产品是一种高效、稳定、快速并可以去除基因组 DNA 污染的反转录系统。试剂盒采 用分子进化技术多点突变的新一代反转录酶 , 大幅度提高了稳定性和反转录效率。本试剂盒为 一管式反转录预混 Mix,5×TRUE RT MasterMix II 中含有反转录第一链合所需的所有试剂 (TRUEscript Hˉ RTase、RNase Inhibitor、Random primers、Oligo dT Primer、dNTP Mixture、Buffer)。 通常 Real Time RT-PCR 等实验需要先用 DNase I 消化去除 RNA 中残 留的基因组 DNA(gDNA) , 但是传统 DNase I 处理复杂并容易造成 RNA 的降解和损失。本试剂 盒中使用了具有 DNA 分解活性的特殊 4×gDNA Eraser Mix 2 分钟消除 gDNA 残留, 不需要DNase 消化和后续繁琐步骤。
产品特点
·新一代反转录酶大幅度提高了稳定性和反转录效率。
·采用 gDNA Eraser 仅需 2 分钟清除 DNA 残留,不需要 DNase 消化和后续繁琐步骤。
·全预混的反转录 Mix,只需加入 RNA 和水,15 分钟简单快速完成反转录。
· 同时 2 种 Mix 在 -20℃不易冻结,减少了化冻和混匀时间,使用更简单。
·本产品针对 qPCR 进行特别优化 oligo dT 和 N6 随机引物配比,使 cDNA 合成可从 RNA 转录 的各个区域起始并具有相同的反转录效率,最大程度保证了 qPCR 结果的真实性和可重复 性。
注意事项
》 避免 RNase 污染。
》 保证反转录成功建议使用高质量的 RNA 样品。
》 4×gDNA Eraser Mix 、5×TRUE RT MasterMix II 非常粘稠, 溶液容易吸附在管壁和 吸头外导致损失,用前请点甩离心后使用,并且避免吸头外壁沾附损失。4×gDNA Eraser Mix 和 5×TRUE RT MasterMix II 内包含的酶均为过量,即使每次按照 3.6 μL-3.8 μL 使用,也 不影响使用效果。
》 可以不经过基因组去除步骤,直接用 5×TRUE RT MasterMix II 进行反转录。
操作步骤(以 20 μL 反应体系为例,也可以采用 10μL 反应体系 )
1. 将 模 板 RNA 和 5×TRUE RT MasterMix II 在 冰 上 解 冻;4×gDNA Eraser Mix 和 RNase free H2O 在室温(15-25℃)解冻,解冻后迅速置于冰上。使用前将每种溶液轻弹或者 轻微涡旋振荡混匀,可简短离心以收集残留在管壁的液体到管底。
2. 在 RNAse free 管里面加入以下成分:( 建议使用 PCR 管冰上配制 )
Components |
Volume |
Total RNA/mRNA |
≤ 12 μL * |
4×gDNA Eraser Mix |
4 μL ( 见注意事项 3) |
RNase free H2O |
to 16 μL(补足到总体积 16 μL) |
*Total RNA 建议不超过 2 μg,mRNA 不超过 200 ng (20μL 体系)。
3. 移液器轻轻吹打混匀,42℃孵育 2 分钟(或者 37℃孵育 5 分钟) 。控温步骤均建议 PCR 仪器上进行。
4. 继续直接在同一管加入如下成份:
Components |
Volume |
5×TRUE RT MasterMix II |
4 μL ( 见注意事项 3) |
5. 移液器轻轻吹打混匀(总体积 20 μL)
如使用 mRNA 模板是来源于真核细胞(如人、小鼠的组织细胞)含有 Poly(A) 尾结构,42℃孵育 15- 20min。
如使用 mRNA 模板是来源于原核细胞(细菌)或者病毒等不含 Poly(A) 尾结构,25℃孵育 10 min, 42℃孵育 15-20min。
注意: 如果模板具有复杂二级结构或高 GC 区域,可尝试将反应温度提高至 50℃,有助于提高产量。
6. 85℃加热 5 min 失活 TRUEscript H- RTase 和 gDNA Eraser。
7. 得到的 cDNA 产物可立即用于 qPCR 反应,或在 -20℃保存,并在半年内使用;长期存 放建议分装后在 -70℃保存。cDNA 应避免反复冻融。
RT-qPCR
取适量反转录 cDNA 产物(一般不超过 qPCR 反应体积的 1/10)作为 qPCR 模板,按照厂 家荧光定量 PCR 试剂说明书进行下一步荧光定量 PCR。 如果表达基因含量丰富,可以根据实 际适当稀释 cDNA 模板使用。