AF488 TUNEL 细胞凋亡试剂盒 ZS-C31009
Superbrilliant® AF488 TUNEL 细胞凋亡试剂盒
Superbrilliant® AF488 TUNEL Apoptosis Kit
Cat.No.: ZS-C31009
Superbrilliant® AF488 TUNEL Apoptosis Kit
Cat.No.: ZS-C31009
组分:
储存：本产品应置于-20°C 储存,组分 103153 需避光,避免反复冻融。有效期见外包装。
注:组分 103152 和 103153 使用时请佩戴口罩和手套,接触皮肤,请立即用大量水冲洗。
简介：细胞凋亡的一个显著特点是细胞染色体 DNA 的降解,这种降解非常特异并有规律所产生的不同长度的 DNA 片段为 180 bp-200 bp 的整数倍,表现为琼脂糖凝胶电泳中呈现特异的梯状 Ladder 图谱。本试剂盒采用 TUNEL 法,应用末端脱氧核糖核苷酸转移酶( Terminal Deoxynucleotidyl Transferase, TdT)在凋亡细胞中断裂 DNA 的 3 -OH 末端催化掺入 AF488，AF 488 标记的 DNA 可以用荧光显微镜直接观察或者用流式细胞仪定量。TUNEL 法可以选择性的检测凋亡细胞,而非坏死细胞或因辐照和药物治疗而造成的 DNA 链断裂的细胞。标记的 dUTP(如地高辛-dUTP、生物素-dUTP),可以直接进行原位检测,是一种更速、直接的检测
手段。
操作方法
实验材料(自备)
PBS 缓冲液(pH~7.4)
4%多聚甲醛(PBS 配制)
牛血清白蛋白(BSA)或正常的羊、牛血清
70%乙醇(自选)
脱蜡溶剂(石蜡切片样本)
实验步骤
1. 样本准备:
(1)细胞样品
a. 可选:准备一份阴性对照样本(加入不含 TdT 酶的 TUNEL 反应液)。
b. PBS 清洗细胞两次。
c. 细胞固定:加适量 4%多聚甲醛(pH 7.4)，4°C 放置 30 min。
d. PBS 清洗细胞两次。
e. 通透细胞:细胞可用配制于 PBS 中的 0.2% Triton X-100 溶液通透,室温放置20 min。
f. PBS 清洗细胞两次。
(2)石蜡组织切片
a. 室温下用二甲苯浸泡石蜡组织切片 2 次,每次 5 min,以彻底脱掉石蜡。
注:二甲苯有毒,易挥发,请在通风橱中进行此操作。
b. 室温下,将样本浸没于无水乙醇中漂洗 2 次,每次 5 min。
c. 室温下,将切片样本连续依次浸没在不同浓度梯度的乙醇(95%、90%、80%、70%)中,每种浓度各漂洗 1 次,每次 5 min。
d. 室温下,将切片浸没于纯水中漂洗 3 min,再将切片浸没于 1×PBS 中漂洗 3 min，用滤纸小心吸干切片样本周围液体。
e. 用免疫组化笔描绘样本轮廓,以便下游通透与标记。
f. 按 1: 100 的比例,将 2 mg/ml 的蛋白酶 K 溶液用 1× PBS 稀释至终浓度 20μg/ml,在每个样本上滴加 100 μl 使溶液覆盖全部样本区域,室温孵育 20 min。(蛋白酶 K 的孵育时间、温度需根据不同类型组织样本进行优化)。
注:蛋白酶 K 可以帮助渗透组织,时间短达不到通透效果, 但延长孵育时间可能导致切片脱落。一般情况下,厚度 4 μm 孵育 10 min,厚度 30 μm 孵育 30min。
g. PBS 浸润清洗切片 2 次,每次 5 min,用滤纸吸去多余的液体,将处理好的样品放在湿盒中保持湿润。
注:这一步必须把蛋白酶 K 洗涤干净,否则会严重干扰后续的标记反应。
(3)冰冻组织切片
a. 将冰冻切片放置于室温的片架上,室温 20min,晾干。
b. 将载玻片浸没在 4%多聚甲醛溶液中,室温固定 30min。
c. PBS 浸润清洗切片 2 次,每次 5 min。
d. 用滤纸小心吸干切片样本周围液体。
e. 按1: 100的比例将2 mg/ml的蛋白酶K溶液用1× PBS稀释至终浓度20 μg/ml,在每个样本上滴加 100 μl,使溶液覆盖全部样本区域,室温孵育 20 min。(蛋白酶 K的孵育时间、温度需根据不同类型组织样本进行优化)。
注:蛋白酶K可以帮助渗透组织,时间短达不到通透效果,但延长孵育时间可能导致切片脱落。一般情况下,厚度 4μm 孵育 10 min,厚度 30 μm 孵育 30 min。
f. PBS 浸润清洗切片 2 次,每次 5 min,用滤纸吸去多余的液体,将处理好的样品放在湿盒中保持湿润。
(4)阳性处理(仅阳性对照进行此步骤，其他样品直接进行 TUNEL 反应步骤)
a. 按 1: 10 的比例用 ddH2O 将 10× DNase I Buffer 稀释成 1× DNase I Buffer 备用。
b. 滴加 100 μl 1× DNase I Buffer 到已通透的样本上,覆盖全部样本区域,室温平衡 5min。
c. 用 1× DNase I Buffer 以 1: 100 稀释 DNase I (2 U/μl)至终浓度 20 U/ml 的工作液。
d. 轻轻吸掉多余液体,加入 100 μl 浓度为 20 U/ml 的 DNase I 工作液,室温孵育10min。
e. 轻轻吸掉多余液体,PBS 清洗样品 2 次。
2. TUNEL 反应
(1)每个样本加入 100 μl TUNEL Equilibration Buffer,室温孵育 5min。
(2)预先配制TUNEL反应混合液:每50 μl TUNEL Reaction Buffer中加入1μl TdT酶。
(3)弃去 TUNEL Equilibration Buffer,每个样本加入 50 μl TUNEL 反应混合液。
a. 贴壁细胞,用盖玻片使缓冲液均匀覆盖样本。37°C 避光孵育 60min。
b. 悬浮细胞可加入微孔板中,采用微孔板振荡器进行孵育或每隔 15min 温和的震荡反应管,使之充分反应。37°C 避光孵育 60min。
c. 组织样本,用盖玻片使缓冲液均匀覆盖样本。将样本平放于湿盒内,37°C 恒温箱孵育 2 h(湿盒底部铺一张含少量水的纸巾保持湿度)。
(4)去掉反应液,在 1× PBS 的染色缸中浸泡润洗 2 次,每次 5min。再使用适量配制于 PBS 中的 0.1% Triton X-100,其中含 5mg/ml BSA 的缓冲液清洗样本 3 次,每次 5min 以降低背景。
(5) 复染(可选):每个样本滴加浓度为 2μg/mL 的 DAPI 染液,室温避光孵育 10min。染色完成后,去掉染液,并将样本在 1× PBS 中浸泡润洗 3 次,每次 5min。
(6) 石蜡切片封片(可选):将切片依次在纯水、70%乙醇、80%乙醇、90%乙醇、95%乙醇、无水乙醇中浸没 5min,最后将切片样本置于染色缸中以新鲜的二甲苯浸泡,透明化处理 2 次，每次 5min。脱水完成后,擦去切片周围的液体,每个样本滴加50μl 抗荧光淬灭封片液,盖上盖玻片,用镊子的钝端轻轻敲击盖玻片,去除气泡以使封片完全。
(7)用荧光显微镜或流式细胞仪观察。(凋亡细胞应被标记上明亮的荧光,没有加入TdT 酶的阴性对照样本不能被 标记上荧光)。
注意事项
1. 荧光染料均存在淬灭问题,保存和使用过程中请尽量注意避光,以减缓荧光淬灭。
2.为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。
现价：
¥
1189.00
原价：
¥1398.00
