pUC57 平黏端通用 TOPO 克隆载体 ZS-M16001
Superbrilliant® pUC57 平黏端通用 TOPO 克隆载体
Superbrilliant® pUC57 Simple TOPO Cloning Vector
Cat.No. ZS-M16001
Superbrilliant® pUC57 Simple TOPO Cloning Vector
Cat.No. ZS-M16001
储存：-20℃可保存 2 年，-80℃可保存 5 年，避免反复冻融。
简介：pUC57 Simple 通用克隆载体采用了 TOPO 酶连接技术，载体预先偶联上 TOPO 酶，当加入 PCR 扩增产物后，5 min 就可以完成连接反应，连接阳性率高。pUC57 Simple 通用克隆载体消除了大部分的常用酶切位点，便于后续亚克隆。该产品适用于 Taq 酶扩增的含“A”尾巴和高保真酶扩增的 PCR 产物的连接，载体含有氨苄青霉素抗性筛选标记。
产品特点
（1）快速连接，最快仅需 5min；（2）操作简单，仅需加入载体和片段即可；
（3）无需蓝白斑筛选，阳性率高；（4）不包含任何酶切位点，便于后续亚克隆；
（5）平末端和 A 尾产物通用。
注意：引物不能磷酸化。
测序引物
正向测序引物：M13F(-47): 5’- CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3’；
反向测序引物：M13R(-48): 5’- AGCGGATAACAATTTCACACAGGA-3’；
pUC57 Simple TA/平端通用克隆载体图谱
操作方法
注意：使用此载体，无需蓝白斑筛选，在准备 LB 琼脂平板时无需加入 X-Gal。
1. PCR 产物的纯化
1.1 PCR 扩增完毕后，电泳检测产物，如无非特异性扩增、无引物二聚体、条带单一明亮，则可采用 PCR 产物纯化试剂盒纯化后用于连接。产物不经纯化也可以进行连接，但效果稍差一些。
1.2 PCR 扩增完毕后，电泳检测产物，如有非特异性扩增条带或引物二聚体，则必须采用胶回收后用于连接。
1.3 PCR 扩增模板来源于 Amp 抗性质粒，则必须采用胶回收后用于连接。
2. PCR 用量和连接时间
3. 连接反应
向 0.2 ml EP 管中依次加入如下试剂
关于 PCR 产物的用量说明：在 PCR 产物回收后（在无法进行 NanoDrop 测定浓度的情况下），按照一般的经验可估算产物的用量，原则为：3 μl 回收产物在琼脂糖凝胶电泳后，可清晰判断的情况下，使用 0.5~1 μl 回收产物（约 5~15ng）进行连 接即可。回收产物难以观察的情况下使用 4 μl 回收产物（约 5~10ng）进行连接。使用过高量的 PCR 产物将会导致连接效 率低下，长斑数量和阳性率急剧下降。
4. 转化
4.1 取 5-10 μl 上一步骤的反应样品加入到 50-100μl DH5α等感受态细胞中(注意所加入的 DNA 样品体积不要超过感受态体积的 1/10)，轻轻混匀，将该混合物置于冰上 30 min。
4.2 42℃水浴中 90 秒进行热激，然后迅速放回冰浴中，静置 3~5 min。
4.3 加入 500 μl 不含抗生素的 SOC 或 LB 培养液，轻轻混匀，37℃震荡培养1h。
4.4 将菌液 5000 rpm 离心 1 min 以沉淀菌体。吸去大部分培养液，剩余约 50-100μl 的培养液，重悬菌体。然后全部均匀涂布到含适当抗生素的 LB 平板上，37℃培养箱中培养过夜。
4.5 第二天挑取平板上的克隆进行菌落 PCR 或者提取质粒进行酶切鉴定，也可以挑取至少 3 个克隆进行测序验证。
5. PCR 菌检挑选阳性克隆菌落（连接产物条带单一、清晰情况下，阳性率>95%，可无需菌检，直接测序，本步骤可省略）
5.1 用 10 μl Tip 头挑取生长良好的单个菌斑，放置于 10 μl 无菌水中吹打几次混合均匀。
5.2 取 1 μl 上述菌液于 20 μl PCR 体系中，用 PCR 特异性引物或者M13F(-47)和 M13R(-48)鉴定阳性克隆。
5.3 以上述菌液为模板进行 PCR 扩增，并电泳检测（如载体自连接，则菌检 PCR扩增长度为：140 bp）。
6. 质粒提取及测序
将鉴定为阳性的菌液接种于 5 ml LB 培养基中（含 100 ug/ml 氨苄青霉素），37°C 振荡（225 rpm）培养过夜，提取质粒。并 使用 M13F(-47)或 M13R(-48)进行测序。
7. 常见问题及分析
7.1 问题：平板克隆数少或不长斑 原因：通常是由于感受态效价较低造成，更换感受态可解决问题。平板为 100 μg/ml 氨苄青霉素抗生素，检查是否用错。
7.2 问题：阳性率低 原因：连接 PCR 产物有引物二聚体、连接产物条带不明亮（浓度不够）。
7.3 问题：鉴定条带大小与预期不符 原因：PCR 产物在回收过程中发生断裂，造成小片段产物，在连接大片段时尤其严重。菌检产物大小为 140 bp＋目标产物 大小，如插入片段为 500 bp，则菌检阳性克隆为 640 bp。
7.4 问题：提取的质粒是否能进行酶切鉴定 回答：该载体上不携带任何常规酶切位点，除非产物自带酶切位点，否则不能酶切鉴定。
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