超敏 Plus ECL 化学发光底物 ZS-PR22004
Superbrilliant® Super Plus ECL Substrate
Cat. No.: ZS-PR22004
组分:
储存：2-8°C ，Super ECL A 要求避光保存，有效期两年。
简介：Superbrilliant® 超敏 ECL 化学发光底物用于 Western、Northern 和
Southern blot 分子杂交的化学发光检测，比传统化学显色法灵敏度高，可达 pg 水平。该产品基于新一代增强型化学发光底物研制而成，采用新型发光底物 (Luminol) ，用于检测辣根过氧化物酶 HRP 标记的抗体及其关联的抗原，其与 二抗上偶联的辣根过氧化物酶反应时产生发光信号强烈持久，在暗室中对 X-光片 感光或者用化学发光成像仪进行检测，可用于检测固定在膜上的蛋白质等生物大 分子，可以此检测微量蛋白而获得理想的实验结果。发光液A 主要成分为 Luminol 及特制发光增强剂，发光液 B 主要成分 H2O2 及特殊稳定剂。发光液 A 与 B 在辣 根过氧化物酶 (HRP) 的催化作用下，鲁米诺与过氧化氢反应生成一种过氧化物， 过氧化物不稳定随机分解，形成一种能发光的电子激发中间体，当后者由激发态 返回至基态，就会产生荧光。增强型 ECL 显色液具有灵敏度高，持续时间长等 特点。
应用:
在 Western 印迹分析，核酸杂交以及 EMSA 实验中，HRP 标记的二抗或探针与 靶分子结合再与底物反应产生可见光。
操作方法 ( 以 Western Blot 为例)
1 ．按每平方厘米膜面积用 0. 1-0.2 ml 配置显色液：根据显色液的需要量，取等 体积 A 液和 B 液，混匀后避光保存备用；该显色液必须现配现用。
2. 取出膜，平放在干净的保鲜膜上，膜的正面 (蛋白质面) 朝上，在膜的中央 加适量的配置好的显色液(6×8 cm 的膜加 2 ml 显色液) ，溶液向四周迅速扩散，覆盖所有膜面。室温保温 5 分钟左右，在此过程中请仔细观察信号的出现。注意： 如果信号强，在暗室中能很快看到阳性信号出现。
3. 待信号出现且稳定后，用镊子夹起膜，除去多余的显色液，平放在干净的保 鲜膜上，膜的正面 (蛋白质面) 朝上，在转移膜的上面再覆盖一层保鲜膜，除去 保鲜膜与转移膜之间的空气泡，请务必保证保鲜膜是干净的，不被其他杂物或液 体污染。
4. 在暗室中，将膜的正面对着 X-光片，放入暗盒。第一次曝光时间在 1 分钟 左右(有经验的操作者可以根据信号的强弱自行决定)，立即按要求对 X-光片进行 显影和定影，确定最佳曝光时间。曝光时间从数秒到数小时不等；特别弱的过夜 曝光也可。
注意:
1.PVDF 膜较硝酸纤维膜能更好的结合蛋白，因此呈现较强的信号。选高质量的 PVDF 膜；尽可能不用 Nylon 膜。
2.与抗体结合以后，要保证膜处于湿润状态，否则会导致背景较高。 3. 没有信号的原因：有些抗体不识别变性抗原，有时需要考虑电泳过程对蛋白质 结构的影响；样品中无待测蛋白质或含量过低；一抗效价低，用量少，可适当增 加一抗的用量；
4.背景过高原因：转移膜封闭不充分；与抗体孵育后洗涤不彻底；膜在处理过程 中过干；二抗用量过多等。
5.注意及时更换显影液、定影液。
6.A 液和 B 液在吸取过程中必须要更换枪头，A 液和 B 液相互污染后会导致 A 液 或 B 液逐渐失效，影响后续的使用效果。
7.开始反应后的30 分钟内萤光更强一些，随后萤光会逐渐减弱，因此请注意充 分利用这萤光较强的30 分钟进行压片。
Fig 1. Western blot 检测 HL-1 细胞、大鼠肾组织裂解的β-actin 蛋白，应用 ECL 发光液分别显色，一抗为β-actin 鼠单抗 1：1000 稀释。
