基因测序为什么要建库

基因测序是生物学、医学等领域中非常重要的研究手段之一，它可以通过获得RNA或DNA序列信息，来研究基因表达水平、突变和遗传变异等。然而，测序技术需要将待测样品进行适当的处理，在处理过程中首先需要建立“文库”或“库”,作为后续分析的基础。

建库的目的是什么？

文库建立的目的非常关键，即将待分析的DNA或RNA序列，构建成为高通量测序仪能够识别的文库样品，从而对后续的分析和解释提供便利。关键作用有三个方面。

一. 提高测序质量

通过预先建立文库，有助于过滤低质量的样品，增强测序的质量。若不建立文库，利用灵敏度较低的测序方法来进行直接测序容易受到有机背景污染、外源DNA、自溢等干扰，测序的质量会较低。

二. 筛选靶区

通过建库，可以对待测样品进行精细的筛选，仅测序目标片段，大大降低运行成本。对于整个基因组的测序，虽然能够全面了解某个物种的基因组信息，但需要大规模的测序，并且有很大的花费，目前在实际操作中，基因组的测序往往不能覆盖到特定的基因序列，而通常只关注几个特定的基因。

三. 分析样品不同层次

文库序列不但可以对DNA或RNA分子的表达水平进行精细测量，还可以分析基因组结构研究、DNA甲基化、蛋白质与DNA相互作用等，可以探究不同层次的数据问题。

建库有哪些方法？

建库是基因测序的前置工作，不同的测序方法需要使用不同类型的库。基因测序常见的建库方法包括：文库构建、PCR扩增、全转录组测序、基因座测序。下面我们来分别介绍一下。

一. 文库建立

文库建立可以将待测DNA或RNA分子转化成可被高通量测序仪读取的文库样品，包括步骤如下：

1. DNA

将DNA加入适配器，根据DNA的大小进行操作，在两端加入适当大小的适配器，从而构建成为文库样品。

2. RNA

RNA分子本身不稳定，在样品提取和加工过程中容易降解。为了不影响后续的实验，我们通常会加入适当的荧光标记，文库将根据RNA的性质不同，进行不同的操作: 具体步骤有：剪切RNA、逆转录、二代测序文库构建。

二. PCR扩增

PCR扩增是建造测序文库的主要方法之一，它可以通过已知的引物设计样品特定区域进行扩增。

PCR扩增测序文库的优点是自身带有拓扑信息，文库按照引物可以对目标区域进行重复扩增，获得更大的片段，而且PCR在引物均一性、特异性等方面更稳定。

三. 全转录组测序

全转录组测序是一种先将RNA样品通过内消旋酶进行消旋，随后利用NP40随机剪切、分离短FRAGmENTS，进行双端双拼接测序。此方法适用于不需要特定引物的变异致病因子分离和定位，但相应的带来了大量噪点和重复品质差的SEQ内容。

四. 基因座测序

基因座测序是以单个DNA片段为基础进行分析的，具体则需要开发针对该片段单个引物及对应的文库设计。基因座测序方法通常被应用于不需要全基因组信息的项目，如对于新染色体变异分析，NGS技术的适用性相当有限，但是基因座方法可以使针对目标DNA序列的精细分析更为可行。

测序建库是方法学的进一步拓展，可以更快速，更便捷地获取信息的重要手段之一。建立高质量、精准的测序文库非常重要，而且测序数据的质量多数取决于库建立的质量。在实验开始前，对产生的样品生成一个质量综合性能评估，并根据需求选择合适的文库建立和测序方案，以最大限度提高信息获取的准确性。