琼脂糖凝胶电泳常见问题分析
琼脂糖是从琼脂中分离得到，由1、3连接的吡喃型b-D-半乳糖和1、4连接的3、6脱水吡喃型阿a-L-半乳糖组成，形成相对分子量为104～105的长链。琼脂糖加热溶解后分子呈随机线团状分布，当温度降低时链间糖分子上的羟基通过氢键作用相连接，形成孔径结构，而随着琼脂糖浓度不同形成不同大小的孔径。表1给出了不同浓度凝胶对DNA片段的线性分离范围。
表1
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琼脂糖/％ |
标准 |
高强度 |
低熔点 |
低粘度 低熔点 |
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0.3 |
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0.5 |
700bp～25kb |
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0.8 |
500bp～15kb |
800bp～10kb |
800bp～10kb |
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1.0 |
250bp～12kb |
400bp～8kb |
400bp～8kb |
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1.2 |
150bp～6kb |
300bp～7kb |
300bp~7kb |
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1.5 |
80bp~4kb |
200bp~4kb |
200bp~4kb |
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2.0 |
100bp~3kb |
100bp~3kb |
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3.0 |
500bp~1kb |
500bp~1kb |
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4.0 |
100bp~500bp |
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6.0 |
10bp～100bp |
由于琼脂糖凝胶是通过氢键的作用，因此过酸或过碱等破坏氢键形成的方法常用于凝胶的再溶化，如NaClO4能用于凝胶的裂解，一般的凝胶回收试剂盒利用的也是这一原理。
随着实验技术的发展，也针对不同用途开发了各种类型的琼脂糖凝胶：
（1）低熔点琼脂糖凝胶，用于DNA片段的回收，且由于该种凝胶中无抑制酶，可在胶中进行酶切、连接等；
（2）高熔点凝胶，可分离小于1kb的DNA片段，专用于PCR产物的分析；
（3）快速凝胶，电泳速度比普通凝胶中快一倍，可节省实验时间；
（4）适用于DNA大片段的分离。
（5）其它类型。各生产商还开发很多类型的凝胶，可根据实验要求选择不同类型的，选择原则是考虑合适的机械强度和熔点。
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问题 |
可能原因 |
解决方法 |
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DNA Marker降解 |
核酸酶污染 |
每次吸取时更换灭菌枪头，勿将电泳缓冲液带入管中；用后密闭4°C保存 |
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保存不当 |
4°C 或-20°C保存，避免多次反复冻融；不可加热 |
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DNA Marker无法正确分离 |
琼脂糖质量差 |
使用质量可靠的琼脂糖制胶 |
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电泳缓冲液多次使用后失效 |
更换缓冲液 |
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条带黯淡 |
核酸浓度过低 |
增加上样量 |
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核酸降解 |
使用不含核酸酶的试剂和耗材制备样品 |
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DNA条带被示踪染料掩盖 |
提高上样量；避免使用与目的片段迁移率相同的示踪染料 |
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条带模糊或弥散 |
电泳缓冲液多次使用后失效 |
更换缓冲液 |
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核酸部分降解 |
使用不含核酸酶的试剂和耗材制备样品 |
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核酸样品纯度差，含有DNA结合蛋白或高浓度的盐份 |
酚/仿抽提或乙醇沉淀去除蛋白、盐份等杂质 |
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电压过低，电泳时间过长 |
根据凝胶大小和电泳缓冲液类型，使用适当的电压进行电泳 |
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染色时间过长或拍照前放置过久，DNA条带弥散 |
电泳结束后及时观察、拍照 |
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条带缺失 |
DNA条带分子量过大 |
使用脉冲凝胶电泳 |
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分子量接近的DNA条带没有分开 |
选择适当的凝胶浓度进行电泳 |
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电泳缓冲液使用不当 |
SD和TBE缓冲液适于分析较小分子量的DNA片段，大片段分子不能完全分离；TAE缓冲液不适于分离很小的DNA片段 |
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电泳时间过长或电压过高，DNA走出凝胶 |
缩短电泳时间，调整电压 |
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电极插反，DNA走出凝胶 |
正确连接电极方向 |
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条带大小不正确 |
核酸降解或形成聚合物 |
加热处理或重新制备样品 |
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λ DNA酶切Marker的cos位点复性 |
电泳前65°C加热5分钟，冰上冷却5分钟以后再上样 |
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相同分子量的DNA片段由于结构或序列的差异而有不同的迁移率 |
判断DNA分子是否有特殊结构，如缺口、超螺旋、二聚体等；富含AT碱基的DNA迁移率比同分子量富含GC碱基的DNA片段慢 |
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梳子变形，点样孔不在同一水平线上 |
使用完好的梳子制胶 |
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带型异常 |
不同样本的上样条件不同 |
选用相同的上样缓冲液，上样量尽可能接近 |
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上样量过大或过小 |
选择合适大小的上样孔，样品应完全覆盖点样孔底部 |
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核酸样品纯度差，含有DNA结合蛋白或高浓度的盐份 |
酚/仿抽提或乙醇沉淀去除蛋白、盐份等杂质 |
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电泳缓冲液未完全浸没凝胶 |
上样和电泳时，确保缓冲液始终能完全覆盖凝胶 |
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电压过高或电泳时间过长致使凝胶过热和DNA变性 |
根据凝胶大小和电泳缓冲液类型，使用适当的电压进行电泳 |
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凝胶中加入EB造成染色不均 |
加入EB时充分混匀或电泳结束后再染色 |
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凝胶中有气泡或污染物 |
使用纯水和洁净容器制胶；缓慢灌胶，并赶除气泡 |
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点样孔质量差 |
待凝胶完全凝聚后再取出梳子 |
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小片段扩散,条带模糊,粗 |
错误选择了低浓度凝胶,观察大片段用低浓度凝胶,观察小片段要用高浓度 |
比如观察100bp的小片段用2%凝胶跑电泳 |
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琼脂糖质量不好,质量不好的琼脂糖分离小片段容易扩散,即使是使用高浓度凝胶 |
换用质量好 的琼脂糖 |
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选择了不合适的电泳缓冲液 |
SD和TBE缓冲液适于分析较小分子量的DNA片段，大片段分子不能完全分离；TAE缓冲液不适于分离很小的DNA片段 |
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