DNA提取试剂盒的工作原理及步骤

DNA提取是分子生物学实验中必不可少的基础实验步骤。因为我们在分子生物学中所做的几乎所有事情在开始都需要 DNA,无论是分子克隆、下一代测序还是其他任何东西。 

如今,大多数实验室都使用商业 DNA 提取试剂盒,这些试剂盒使用硅胶自旋过滤法来获得高质量的 DNA。这些可以快速有效地纯化 DNA。但这确实意味着很多人只是按照说明操作,并不了解 DNA 提取试剂盒的工作原理。
 

为什么要了解核酸提取试剂盒的工作原理? 

离心柱包含一种硅胶树脂,可根据条件和受提取方法影响的其他因素选择性地结合 DNA 和 RNA。这些 DNA 提取试剂盒使整个过程比旧的 DNA 分离方法更容易、更快。但是,使用的缺点是,如果您不了解套件的黑匣子中的内容,则会使故障排除变得更加困难。
因此,在本文中,我将详细解释 DNA 提取试剂盒的工作原理以及每一步的操作。
我还将讨论在 DNA 提取中使用硅胶柱的一些常见问题,只要稍微了解一下就可以克服或避免这些问题。
 

一、 RNA和DNA提取

裂解:裂解公式可能因您要提取 DNA 还是 RNA 而异,但共同点是含有高浓度离液盐的裂解缓冲液。
Chaotropes(离液剂)的作用:Chaotrope会破坏氢键及疏水间的相互作用。离液盐包括盐酸胍、硫氰酸胍、尿素和高氯酸锂。
洗涤剂:除了离液剂外,裂解缓冲液中通常还有一些去污剂,以帮助蛋白质溶解和裂解。
溶菌酶和蛋白酶K:根据样品类型,也可以使用酶进行裂解。蛋白酶 K 就是其中之一,实际上在这些变性缓冲液中效果较好;当蛋白质变性增多,蛋白酶 K 的作用也会相应增强。然而,溶菌酶在变性中不起作用,因此溶菌酶处理通常在添加变性盐之前进行。

、DNA 提取后纯化:将 DNA 与柱结合

离液盐对于裂解至关重要,而且对于将 DNA(或 RNA)与色谱柱结合也是如此。此外,为了增强和影响核酸与二氧化硅的结合,还添加了酒精。
大多数情况下这是乙醇,但有时可能是异丙醇。乙醇百分比和体积有很大的影响。太多,你会带入大量降解的核酸和小物种,这会影响 A260 读数并降低你的一些产量。太少,可能难以从膜上洗掉所有盐分。
如果您在裂解中使用含有 SDS 的去污剂,请尝试使用NaCl 作为沉淀剂, 以避免去污剂污染 DNA 或 RNA。
 

、洗涤 DNA(或 RNA)

当裂解物通过硅胶膜进行离心分离,现在所提取的 DNA 或 RNA 应该与柱子结合,杂质、细胞蛋白和多糖应该已经通过了。 但是,膜仍然被残留的细胞蛋白质和盐弄脏。如果样品来自植物,仍然会有多糖,也许一些色素留在膜上,或者如果样品是血液,膜可能会被染成棕色或黄色。

洗涤步骤用于去除这些杂质。通常有两次洗涤,尽管这可能因样品类型而异。第一次洗涤通常会含有少量的离液盐,以去除蛋白质和有色污染物。这之后总是用乙醇洗涤以除去盐。

如果开始的准备工作没有大量蛋白质,例如质粒准备或 PCR 清理,则只需要乙醇洗涤。去除离液盐对于获得高产量和高纯度的 DNA 或 RNA 至关重要。一些试剂盒甚至会用乙醇清洗柱子两次。如果残留盐分,核酸的洗脱会很差,A230读数会很高,导致260/230的比率很低。对于无乙醇 DNA 和 RNA,需要进行干法离心,乙醇洗涤后,大多数方案都有一个离心步骤来干燥柱子。这是为了去除乙醇,对于清洁的洗脱液是必不可少的。当将 10 mM Tris 缓冲液或水应用于膜进行洗脱时,核酸会水合并从膜中释放出来。如果色谱柱上仍有乙醇,则核酸无法完全再水合。如果跳过干燥步骤会导致乙醇污染和低产量。很可能在 Nanodrop 上看不到乙醇吸光度,所以它不会出现在您的读数中。

、RNA 和 DNA 提取:洗脱

DNA 提取方案的剩余的步骤就是从硅胶中释放纯 DNA 或 RNA。对于使用DNA提取试剂盒进行DNA制备,通常使用 pH 值为 8-9 的 10 mM Tris。DNA 在弱碱性 pH 值下更稳定,在缓冲液中溶解得更快。即使对于 DNA 颗粒也是如此。水的 pH 值往往较低,低至 4-5,并且高分子量 DNA 在用于洗脱的短时间内可能无法完全再水合。

通过在离心前让缓冲液在膜中停留几分钟,可以较大限度地洗脱 DNA。
由于RNA 易溶于水,且RNA 利于处在微酸性的 pH 值环境下。

核小体(北京)生物技术有限公司生产的全血 / 组织 / 细胞基因组DNA快速提取试剂盒产品具有以下特点:

1.不需要使用有毒的苯酚等试剂,也不需要乙醇沉淀等。

2.快速,简捷,单个样品操作一般可在 30 分钟内完成。

3.多次柱漂洗确保高纯度,典型的产量200µl 全血可提取出3-6µg,OD260/OD280 典型的比值达 1.7~1.9,长度可达 30 kb-50kb,可直接用于 PCR、Southern-blot 和各种酶切反应。

4.从十几个配方中优选出的红细胞裂解液配方,裂解快速完全,客户可根据需要选择购买。

5.典型的产量 200µL 全血可提取出 3-6µg 基因组 DNA。

 

产品图片

技术服务

Technical services

技术服务