无缝克隆和传统酶切克隆大比拼

在经历了多次PCR、酶切、连接、转化后，有些小伙伴仍会面临克隆阳性率低的情况，每一步都认真地完成，但仍然存在不少的问题。今天给大家介绍一下近年来备受青睐的“无缝克隆”。相比于传统的酶切克隆，无缝克隆更快更灵活，不受酶切位点限制，可以在质粒的任何位点进行一个或多个DNA片段的插入。

传统酶切克隆

1.受限制性内切酶的限制

2.连接效率低：T4 DNA连接酶连接效率具有序列的偏好性

3.耗时长：酶连过夜

4.多片段克隆困难

无缝克隆

1.无需考虑酶切位点，适用任意载体、任意片段

2.阳性率高，可用于50 bp -10 kb的片段

3.连接快速，20-30 min即可完成

4.可用于多片段克隆、基因突变、多顺反子表达载体构建

无缝克隆的原理

与传统的双酶切克隆一般，无缝克隆依赖于dsDNA的黏性末端进行互补配对，但无缝克隆并不使用内切酶来制造黏性末端，而是通过T5核酸外切酶来产生。T5核酸外切酶能够沿着5’→3’方向，降解dsDNA，从而产生黏性末端，但是，T5外切酶并不能保证每一个片段5’端都会酶切成一样长的粘性末端。因此退火之后，无缝克隆中的DNA聚合酶会针对缺失的碱基进行添加，Taq连接酶催化碱基之间形成磷酸二酯键，将所有缺口补齐。

无缝克隆优势详解

1.不受片段、载体序列的限制，可任意组装

传统的酶切克隆：克隆载体的多克隆位点需携带可用的单一酶切位点，同时酶切位点若存在于外源片段也会极大程度限制克隆。此外，还需要购买各式各样不同的内切酶。

无缝克隆：仅靠同源臂进行互补配对。

2.可同时无缝地拼接多个片段

传统的酶切克隆：由于酶切位点的限制和酶切位点之间存在着一定的距离和交叉覆盖，可组装的片段有限，酶切克隆通常需要分多次拼接，一般只能拼接2-3个片段，耗时耗力。

无缝克隆：可同时拼接4-6个片段，并且只需要将所有片段混在一个试剂管中反应即可。

3.操作简便，时间上大大节省

传统的酶切克隆：传统的片段和载体酶切均需要2-4小时，此外还需要对相关产物进行末端补平、磷酸化、产物纯化等一系列操作。为保证连接成功，还需在16℃条件下过夜连接。

无缝克隆：仅需PCR和胶回收，连接体系反应时间为20min左右，连接单个和多个片段的时间一致。相比于传统酶切克隆，可节约1天左右的时间。

核小体（北京）生物技术有限公司生产的一步法无缝克隆试剂盒不依赖于 T4 连接酶，不受载体和目的片段的酶切位点限制，而直接用重叠片段重组的方法，采用特殊的酶组合可以将任意方法线性化后的载体和与其两端具有 16- 25bp 重叠区域的 PCR 片段定向重组连接，可以 30 分钟内实现平末端 PCR 产物片段高效定向无缝克隆至载体的任意位点。

无缝克隆操作步骤