PCR百P不出，原因在哪里？
PCR真的如此简单吗？为什么PCR做不出来？为什么PCR要设温盖？为什么PCR重复不了…….这个简单的技术看来难倒了不少人。作为一个浸淫PCR多年耗尽无数MIX的老鸟，且听我娓娓道来个中原因。
问题出在哪里呢？是体系的成分问题。我们知道一个Premix 已经包含了PCR反应所需要的Mg2+，Buffer，酶，dNTPs等成分。而这些成分随着不同的模板和反应所需要的量并不都是固定的。这也就是导致了很多人同样厂家的产品P不同的基因，A基因可以完美P出来，而B基因却死活P不出来，甚至即使P出来结果也很差。如下左图，PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带；抑或下右图的拖尾现象。
这些情况很可能就是因为Premix中酶量过多或者Mg2+浓度偏高。这时候就要考虑适当加大稀释倍数。当然，作为一个复杂的反应，在PCR反应过程中我们可能遇到各式各样难以解释的问题。
PCR诸般问题，Mix独占三分。倘若在百P不出而你又实在找不到原因，那就要回头认真考虑下Mix组分的问题。有人要问了Mix都占据了三分呢？剩下的就是模板和引物了。但是，qPCR不在这个随意的范围内，由于qPCR对引物的高质量要求使得我们随便不得，稍微不注意便会使得反应的特异性下降从而导致实验失败。那么剩下的只有模板可选了，模板的添加问题可能很多人忽略，往往随便加点就行了。大多数时候这样没毛病，完全P的出来，但是，倘若你刚好就遇到了那少数P不出来的时候，那就可能百思而不得其解了。
我们先来看看PCR反应标准的模板要求是什么？
从图中我们可以看出不同类型模板所添加的质量是不一样的，而过量或者过少的模板量都极有可能导致P不出来，所以这是我们第一个要注意的。
此外，我们的目的基因都由AGCT四种碱基组成，大多时候我们的模板里的四种碱基并不是均匀分布的，一般我们认为GC含量40%-60%之间是正常的模板。而如果不巧你的模板就是高于这个含量或者低于这个含量，我们称之为“富含GC或AT模板”。这个也是导致很多PCR或者测序失败的重要原因。面对这种情况，如富含GC的模板，我们可以通过添加适量的DMSO来达到奇效。
最后就是上机程序的问题，这个问题说大也大，说小也小，请认真阅读PCR mix的说明书，严格按照操作来进行。同时，适当调整退火温度，仅此而已。
幸福的PCR都是相似的，不幸的PCR各有各的不幸。人都有一个习惯，越是熟悉越容易看到的东西，越容易被忽略。PCR虽说并不是个复杂的过程，但经常会因为经验性的熟悉而遇到各种各样棘手的问题，有的甚至能卡在这一步两三个月之多简直是令人痛心疾首。好了，今天就聊到这里，希望对大家有帮助。
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