PCR百P不出,原因在哪里?

PCR真的如此简单吗?为什么PCR做不出来?为什么PCR要设温盖?为什么PCR重复不了…….这个简单的技术看来难倒了不少人。作为一个浸淫PCR多年耗尽无数MIX的老鸟,且听我娓娓道来个中原因。

 

问题出在哪里呢?是体系的成分问题。我们知道一个Premix 已经包含了PCR反应所需要的Mg2+,Buffer,酶,dNTPs等成分。而这些成分随着不同的模板和反应所需要的量并不都是固定的。这也就是导致了很多人同样厂家的产品P不同的基因,A基因可以完美P出来,而B基因却死活P不出来,甚至即使P出来结果也很差。如下左图,PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致,或大或小,或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带;抑或下右图的拖尾现象。

 

 

这些情况很可能就是因为Premix中酶量过多或者Mg2+浓度偏高。这时候就要考虑适当加大稀释倍数。当然,作为一个复杂的反应,在PCR反应过程中我们可能遇到各式各样难以解释的问题。

 

PCR诸般问题,Mix独占三分。倘若在百P不出而你又实在找不到原因,那就要回头认真考虑下Mix组分的问题。有人要问了Mix都占据了三分呢?剩下的就是模板和引物了。但是,qPCR不在这个随意的范围内,由于qPCR对引物的高质量要求使得我们随便不得,稍微不注意便会使得反应的特异性下降从而导致实验失败。那么剩下的只有模板可选了,模板的添加问题可能很多人忽略,往往随便加点就行了。大多数时候这样没毛病,完全P的出来,但是,倘若你刚好就遇到了那少数P不出来的时候,那就可能百思而不得其解了。

 

我们先来看看PCR反应标准的模板要求是什么?

 

 

从图中我们可以看出不同类型模板所添加的质量是不一样的,而过量或者过少的模板量都极有可能导致P不出来,所以这是我们第一个要注意的。

 

此外,我们的目的基因都由AGCT四种碱基组成,大多时候我们的模板里的四种碱基并不是均匀分布的,一般我们认为GC含量40%-60%之间是正常的模板。而如果不巧你的模板就是高于这个含量或者低于这个含量,我们称之为“富含GC或AT模板”。这个也是导致很多PCR或者测序失败的重要原因。面对这种情况,如富含GC的模板,我们可以通过添加适量的DMSO来达到奇效。

 

最后就是上机程序的问题,这个问题说大也大,说小也小,请认真阅读PCR mix的说明书,严格按照操作来进行。同时,适当调整退火温度,仅此而已。

幸福的PCR都是相似的,不幸的PCR各有各的不幸。人都有一个习惯,越是熟悉越容易看到的东西,越容易被忽略。PCR虽说并不是个复杂的过程,但经常会因为经验性的熟悉而遇到各种各样棘手的问题,有的甚至能卡在这一步两三个月之多简直是令人痛心疾首。好了,今天就聊到这里,希望对大家有帮助。

 

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